生物顯微鏡與光學濾光片

一、暗視野顯微鏡
(一) 原理和結構特點 
在日常生活中，室內飛揚的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒?？梢娏?，這是光學上的丁達爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設計的。它的結構特點主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋．不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內，因而整個視野是黑暗的。在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像．并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細微結構。但被檢物體為非均質時，并大于1／2波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結構，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。 
(二) 制作中央遮光板 
普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無暗視野聚光器時，可用厚黑紙片制作一個中央遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果。
1．將顯微鏡聚光器調到最高位置，用低倍鏡對好焦距。 
2．取下目鏡，從鏡筒中觀察并調節(jié)光闌的大小，使其與鏡筒中所見物鏡的視野相等。 
3．用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相同，中央部分的大小與調節(jié)好的光闌孔徑一樣(可用半透明的小紙片，放在通光孔處聚光鏡鏡面上，紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑，再用圓規(guī)量取大小)。 
4．將中央擋光板放在濾光片框架上，開大光闌進行樣品觀察。 
如需使用高倍鏡作暗視野觀察，應按高倍鏡對焦后的視野大小重新制作中央擋光板。 
保存好各自制作的中央遮光板，以便在后面的實驗中使用。 
（三）使用方法 
1．把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上。 
2．選用強的光源，但又要防止直射光線進入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明。 
3．在聚光器和標本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面進行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。 
4．升降集光器，將集光鏡的焦點對準被檢物體，即以圓錐光束的頂點照射被檢物。如果聚光器能水平移動并附有中心調節(jié)裝置，則應首先進行中心調節(jié)，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。 
5．選用與聚光器相應的物鏡，調節(jié)焦距 操作方法與普通顯微鏡相同，找到所需觀察的物像。 
（四）觀察 觀察示教臺上暗視野顯微鏡下的活細胞。在黑暗的背景里，可見細胞、細胞核和細胞器的衍射光圖像。 
二、相差顯微鏡 
(一) 原理和結構特點 
光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不同。當光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本的道理。而活細胞和未經(jīng)染色的生物標本，因細胞各部微細結構的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應發(fā)生的差異即相差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。 相差顯微鏡(圖2—3)與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。相板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調軸望遠鏡是用來進行合鈾調節(jié)的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環(huán)f狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。 
(二)使用方法 相差裝置為多功能系列顯微鏡中的附屬裝置．與普通顯微鏡配合使用。
1．相差裝置的調換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 
2．調焦 打開光源，旋轉集光器轉盤，將“o”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調焦。 旋轉環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應，如相差物鏡為40 x時應用x40標示孔的光闌。 
3．合鈾調整 拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡內內觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉動望遠鏡內筒使其下降，當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，然后左右前后調節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合＜圖2—4，如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內側時，應降低集光器使亮環(huán)放大；反之，則應升高聚光器，使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合，則可能是載玻片過厚之故，應更換。合抽調整完畢，抽出望遠鏡，換回目鏡，按常規(guī)要領進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調整。使用油鏡時，集光器上透鏡表面與載玻片之間要同時加上香伯泊。 
(三)觀察 在相差顯微鏡下觀察活細胞，可清楚地分辨細胞的形態(tài)，細胞核、核仁以及胞質中存在的顆粒狀結構。

三、熒光顯微鏡 
(一)原理和結構特點 熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。 熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發(fā)光照射后，在極短時間內發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛?二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。
熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：
1．透射式熒光顯微鏡 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光的(圖2—5)。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉射和旁射到標本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．所以對觀察較大的標本材料較好。
2．落射式熒光顯微鏡 這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(圖2—6)。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。


（二）使用方法．

1．打開燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點。 
2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。 
3．用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調節(jié)裝置，調整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。 
4．放置標本片，調焦后即可觀察。 使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。
(三)觀察 在示教臺上的熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，可見經(jīng)o．01％的丫啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。